Elektroforeza kapilarna

Elektroforeza kapilarna (ang. capillary electrophoresis (CE)) to grupa technik instrumentalnych stosujących rozdział substancji pod wpływem napięcia elektrycznego, w kapilarze. Pod względem cech można ją uznać za połączenie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC). Do jej najważniejszych zalet należą:

• możliwość zautomatyzowanej pracy
• wysoka sprawność
• niskie wykorzystanie odczynników
• mała ilość próbki
• krótki czas analizy
• zastosowanie do szerokiego wachlarza związków

Aparatura

Budowa aparatu i sam proces są dość proste. Należy przygotować kapilarę (około 75 um średnicy, 60 cm długości) z topionej krzemionki, wyposażyć ją w okienko obserwacyjne, a oba jej końce zanurzyć w dwóch zbiornikach (fiolkach) z buforem. Do owych zbiorników potrzeba włożyć elektrody i przyłożyć do nich napięcie (około 30 kV). Natomiast przy okienku pomiarowym umieszcza się detektor (np. UV-Vis).

Firma Sciex, uznany na świecie producent aparatów do elektroforezy kapilarnej (wcześniej pod marką Beckman Coluter) oferuje szereg urządzeń zapewniających szeroki wachlarz zastosowań, m.in.

• P/ACE MDQ Plus: zautomatyzowany, programowalny aparat system stworzony do wykonywania szybkich testów np. żywności, ale też badań naukowych
• PA 800 Plus: elastyczna platforma do wielu analiz, zaprojektowana z myślą o wymagających warunkach branży farmaceutycznej
• CESI 8000 Plus: urządzenie zwiększające zdolności analityczne, o ogromnej czułości dzięki zastosowaniu elektrorozpylania i spektrometrii mas
• Intabio ZT: system łączący separację icIEF i detekcję UV ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości
• BioPhase 8800: wielokapilarny system elektroforezy, opracowany dla laboratoriów biofarmaceutycznych wykonujących dużą liczbę analiz

Zasada działania

W takim układzie, przy odpowiednim pH dochodzi do przepływu (elektroosmotycznego) przez kapilarę, od anody do katody. Można tu zauważyć, że przepływ ten jest inny od hydrodynamicznego, znanego w wysokosprawnej chromatografii cieczowej, co znaczniej podnosi sprawność tej techniki.

Zawarte w buforze substancje przemieszczają się z różną szybkością, zależną od szeregu czynników. W najprostszym ujęciu prędkość elektroforetyczna jest wprost proporcjonalna do ładunku i odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki.

Mijając okienko pomiarowe, dają sygnał na detektorze. Stosowane są najczęściej detektory znane z wysokosprawnej chromatografii cieczowej: UV-Vis, PDA, LIF (fluorescencyjny), MS. Powstaje w ten sposób wykres zależności intensywności sygnału od czasu (migracji), podobny w wyglądzie do chromatogramu.

Rodzaje technik elektroforetycznych

Wyróżniane jest kilka typów elektroforezy kapilarnej, w zależności od zastosowanych warunków:

• strefowa elektroforeza kapilarna (ang. capillary zone electrophoresis (CZE))

Najprostszy rodzaj, w którym mechanizm rozdziału oparty jest o stosunek ładunku do masy. Poszczególne składniki próbki rozdzielają się na odrębne strefy. Proces odbywa się w niezmiennym składzie buforu i stałym polu elektrycznym.

Ta technika jest bardzo popularna w rozdziale białek i peptydów, gdyż można uzyskać separację dla analitów różniących się zaledwie jednym aminokwasem. Inne zastosowania obejmują nieorganiczne aniony i kationy, podobnie jak przy zastosowaniu chromatografii jonowej. Rozdział małych cząsteczek, np. farmaceutyków, również jest możliwy, jeśli tylko są one naładowane.

• izoelektryczne ogniskowanie kapilarne (ang. capillary isoelectric focusing (CIEF))

Migracja cząsteczek następuje w wyniku ich naładowania, przy czym stosowany jest gradient pH, uzyskany za pomocą amfolitów. Po przyłożeniu napięcia mieszanina amfolitów rozdziela się w kapilarze do momentu, gdy osiągnie swój punkt izoeletryczny, w którym ładunek netto wynosi zero.

Ta technika pozwala uzyskać wysoki rozdział białek, np. immunoglobulin, wariantów hemoglobiny i potranslacyjnych modyfikacji białek rekombinowanych. Ponadto, za jej pomocą można określić punkt izoelektryczny białek.

• żelowa elektroforeza kapilarna (ang. capillary gel electrophoresis (CGE))

Separacja następuje w kapilarze wypełnionej żelem, który działa jak sito molekularne.

Z tego powodu technika ta odnalazła szczególne zastosowanie w rozdziale białek. Są one zdenaturowane w roztworze zawierającym SDS, który zapewnia im identyczny stosunek ładunku do masy. Inną grupą związków są oligonukleotydy i kwasy nukleinowe, dla których można określić np. czystość.

• izotachoforeza (ang. capillary isotachophoresis (CITP))

Separacja zachodzi pomiędzy dwoma buforami (wiodącym i kończącym), na zasadzie różnic w mobilności poszczególnych cząsteczek.

Technika ta odnajduje zastosowanie w oznaczaniu kationów lub anionów. Ze względu na unikalną cechę ich skupiania czasem jest używana jako sposób do wstępnego zagęszczania związków przed poddaniem ich strefowej elektroforezie kapilarnej.

• micelarna elektrokinetyczna chromatografia (ang. micellar electrokinetic chromatography (MEKC))

Przy określonym stężeniu surfaktantów w wodnym roztworze tworzą się micele. W ich hydrofobowych wnętrzach znajdują się cząsteczki analitu. Tak utworzone agregaty poruszają się z inną prędkością niż związki, które pozostały niezwiązane w fazie hydrofilowej.

Technika ta świetnie nadaje się do rozdziału związków chiralnych ze względu na ich różną zdolność do tworzenia miceli, a także małych cząsteczek.

Czy elektroforeza kapilarna jest dla mnie?

Elektroforeza kapilarna jest techniką zdolną do pracy z bardzo wieloma związkami, będąc komplementarną do innych technik i niejednokrotnie przewyższając je w swoich zdolnościach.

Poniższa tabela może być pomocna w wyborze najkorzystniejszego trybu elektroforezy jako punktu wyjścia w opracowywaniu metod.

Skontaktuj się z nami, aby uzyskać więcej informacji o elektroforezie kapilarnej. Nasi specjaliści pomogą Ci dobrać aparaturę i poznać lepiej tę technikę. Dzięki temu Twoja praca będzie najefektywniejsza, a Ty osiągniesz granice, które do tej pory były niedostępne.